Jak a proč využíváme analýzu DNA při monitoringu kočky divoké v Západních Karpatech?

28.06.2021

Součástí česko-slovenského projektu „Hledáme kočku, pozor, divokou!” je také sběr a analýza genetických vzorků. V rámci projektu věnujeme pozornost především sběru a výzkumu vzorků neinvazivních (tedy takových, při kterých není potřeba přijít do přímého kontaktu se zvířetem, např. trus, moč nebo chlupy), v některých případech ale analyzujeme také vzorky invazivní (tzn. odebrané přímo z tkáně konkrétního jedince - k tomu může dojít např. v případě sraženého zvířete na silnici). Jak takovou analýzu provádíme a proč výzkum probíhá? 

              

Kočka domácí a kočka divoká, jak jsou příbuzné?

Kočka divoká (Felis silvestris) není zdivočelou kočkou domácí (Felis catus), a není ani jejím přímým předkem. Kočka domácí ve skutečnosti pochází ze sesterského druhu evropské kočky divoké - kočky plavé (Felis lybica) žijící v severní Africe a na Blízkém východě. Proces domestikace kočky začal zhruba před 12 tisíci lety v oblasti vzniku prvních starověkých civilizací, podobně jako u některých jiných, dnes chovaných domácích zvířat (např. kozy, ovce). Pravděpodobně šlo o oblast dřívější Mezopotámie. Ve větším rozsahu domestikace pokračovala ve starověkém Egyptě, kde kočku uctívali jako ztělesnění bohyně Bastet. V rámci Evropy pak kočku domácí rozšířili během starověku Římané. Kočka domácí se proto od kočky divoké liší nejen morfologickými znaky, ale především geneticky.

               

Křížení kočky divoké s kočkou domácí ohrožuje celou evropskou populaci „divošek”

Jedna z definic druhů říká, že: „Druh je soubor populací s jedinečným vývojovým původem a historií, tvořený navzájem si podobnými jedinci, kteří se mezi sebou mohou plodně křížit a jsou reprodukčně izolováni od jiných podobných skupin [1].” Bohužel hlavně poslední bod neplatí vždy. Pokud k oddělení druhů došlo teprve nedávno (přičemž z hlediska evoluce může nedávno znamenat i několik desítek tisíc let), reprodukční bariéra mezi druhy ještě nemusela vzniknout. Tak je to i v případě kočky divoké a kočky domácí, které se dovedou bez problémů křížit a mít plodné potomstvo. Následkem jejich křížení se mohou geny kočky domácí včlenit do genomu kočky divoké. To může způsobit jednak narušení adaptací, kterými je kočka divoká přizpůsobena životu v lesním prostředí, navíc ze šlechtěných (a někdy až přešlechtěných) kočičích mazlíčků se mohou do genomu kočky divoké dostat i škodlivé mutace, které způsobují geneticky podmíněné nemoci, nejrůznější vývojové vady nebo mohou negativně ovlivňovat rozmnožování druhu.      

Křížení (odborně hybridizace) s kočkou domácí se proto uvádí jako jeden z významných faktorů ohrožující evropské populace koček divokých. Různé studie v rámci Evropy, které zkoumaly problematiku hybridizace divokých koček, se ve svých výsledcích významně liší. Zatímco např. v Maďarsku či ve Skotsku jsou populace kočky divoké výrazně ovlivněny hybridizací s kočkami domácími, v jiných evropských zemích jsou naopak populace divokých koček relativně nedotčené, např. v Německu identifikovali vědci v populaci pouze 3.5 % hybridů. A právě situace v okolních zemích poukazuje na nutnost co nejdříve zjistit, v jakém stavu je populace kočky divoké v Západních Karpatech, jež představují významné refugium (útočiště) pro tento druh. Jedná se proto i o jeden z hlavních cílů projektu.

               

Nejvěrohodněji rozliší kočku domácí, kočkou divokou a prvních několik generací jejich hybridů genetická analýza

Pro rozlišení kočky divoké a kočky domácí existuje několik diagnostických znaků. Jako jeden z nejlepších morfologických rysů se uvádí rozdíly ve velikosti mozkovny. Tento znak lze ale využít jen, pokud je dostupná lebka daného jedince, tedy až po jeho smrti. Další znaky se týkají zbarvení srsti. Jde např. o počet a pozici pruhů na zádech, na bocích těla nebo délku, tloušťku a zbarvení ocasu (obr. 1). Bohužel tyto znaky jsou obtížně využitelné zejména v případě hybridních jedinců. Diplomová práce Anny Eichholzer z roku 2010 ukázala, že ani evropští experti na výzkum koček nebyli schopni správně rozpoznat dle fotografií z fotopastí kočky divoké od koček domácích a zejména správně identifikovat hybridní jedince, u nichž bývá fenotyp (vzhled) podobný kočce divoké [2].


A právě zde využívá genetická analýza, která dokáže tyto dva druhy včetně jejich hybridů od sebe bezpečně odlišit. Pro analýzu je možné využít téměř jakýkoliv biologický materiál, který za sebou živočich zanechá při pohybu v terénu a který obsahuje jeho buňky. Mezi tyto tzv. neinvazivní genetické vzorky patří například chlupy, kde se DNA získává z chlupových kořínků nebo trus či moč, u nichž se DNA nachází v buňkách odloupnutých z výstelky střeva nebo močových cest.


Obr. 1: Základní rozlišovací znaky mezi kočkou divokou a kočkou domácí

               

Se sběrem vzorků na genetickou analýzu pomáhají tzv. chlupové pasti

Získat genetické vzorky kočky divoké neinvazivní metodou ale není jednoduché. Tato menší šelma žije poměrně skrytým způsobem života a v zimě navíc upřednostňuje pohyb mimo souvislou sněhovou pokrývku. Nalézt její pobytové znaky nebo i genetický materiál je tak mnohem náročnější než třeba v případě vlka nebo rysa. Pro sběr vzorků se proto začaly využívat tzv. chlupové pasti (angl. hair-trapping). Monitoring pomocí chlupových pastí patří mezi standardně využívané neinvazivní metody monitoringu vhodné pro studium genetické variability a prostorové aktivity různých druhů kočkovitých šelem včetně kočky divoké.

Chlupové pasti jsou nejčastěji jednoduché dřevěné kůly se zářezy, které mohou být navíc vybaveny suchým zipem nebo jiným materiálem, zvyšujícím pravděpodobnost uchycení co největšího počtu chlupů. Na tyto kůly se také nanáší pachový atraktant, který u kočkovitých šelem vyvolává tzv. rubbing behaviour”, tedy chování, při kterém se kočky o tyto kůly otírají a zanechávají na nich své chlupy (obr. 2). Jako pachové atraktanty se využívají určité látky, které na kočkovité šelmy působí přitažlivě a vyvolávají u nich popsanou reakci. Předmět napuštěný danou látkou se totiž snaží přeznačit nebo dotyčný pach přenést na sebe. Nejčastěji se jedná o výtažky ze dvou rostlin: z šanty kočičí (Nepeta cataria) a z kozlíku lékařského (Valeriana officinalis). Proč jsou tyto vůně pro kočkovité šelmy tak atraktivní se přesně neví. Obdobný účinek ale mají i na naše domácí kočičí mazlíčky a sušené části těchto rostlin se proto často nachází v různých hračkách pro domácí kočky.   


 Obr. 2: Kočka divoká u chlupové pasti; zdroj: ZOO Bojnice

                                                                         

Pokud tedy máme genetické vzorky, můžeme se pustit do samotné genetické analýzy. Pro analýzu se využívají genetické markery (určitý vybraný úsek DNA sloužící jako diagnostický znak), které sice pokryjí jen zlomek celého genomu, ale pokud jsou vhodně vybrané (typ, umístění na jednotlivých chromozomech, dostatečný počet), je možné získané výsledky zobecnit. Dosud nejběžnější metoda, která se využívá pro potřeby ochranářské genetiky je analýza tzv. mikrosatelitů (krátký úsek DNA s opakující se sekvencí 2-6 nukleotidů, tedy základních stavebních kamenů DNA). Při našem výzkumu využíváme sadu 25 mikrosatelitů včetně markeru na určení pohlaví. Mikrosatelity se v populaci nachází v různých formách, variantách - alelách. Kombinace různých alel u všech námi zkoumaných mikrosatelitů je pro každého jedince unikátní a nazýváme ji genotyp (= genetický otisk prstu). Pro každý mikrosatelit vždy máme jednu alelu, kterou jedinec zdědil od své matky a jednu, kterou má po svém otci. Tyto alely mohou být stejné (při analýze pak získáme jen jednu alelu a jedinec je pro daný mikrosatelit homozygot) nebo různé (při analýze získáme dvojici různě dlouhých alel a jedinec je pro daný mikrosatelit heterozygot) (obr. 3).


             Obr. 3: Délkový polymorfizmus u 6 z 25 analyzovaných mikrosatelitů u dvou jedinců kočky divoké analyzovaný v programu Genemapper. Jednotlivé mikrosatelity jsou označeny čtyřmi fluorescenčně značenými barvami, za pomocí kterých je možné je od sebe odlišit. Alelu označuje poslední (vybarvený) pík, kterého délka na ose x se odečítá. Např. v případě zeleně označeného nejkratšího mikrosatelitu jsou u horního jedince přítomny dvě alely (heterozygot) u spodního jen jedna (homozygot).

               

Genetická analýza dokáže identifikovat konkrétní jedince, příbuzenské křížení i možnou izolovanost jednotlivých populací

Pomocí této metody zjistíme o divokých kočkách všechny důležité informace, potřebné k jejich účinné ochraně. Za pomoci unikátních genotypů můžeme identifikovat jednotlivé jedince, zjistit jejich příbuzenské vztahy, genetickou rozmanitost populace (která je důležitá z hlediska její životaschopnosti), zda v ní dochází k příbuzenskému křížení (angl. inbreeding) nebo jestli je zkoumaná populace izolovaná od jiných. Můžeme také odhadnout prostorovou aktivitu jedinců a početnost populace. Zároveň tak lze rozlišit kočky divoké od koček domácích a identifikovat hybridní jedince (obr. 4).

To, jak daleko do minulosti jsme schopni vystopovat hybridního jedince po jeho zpětném křížení v rámci jednoho druhu, závisí na množství použitých markerů a množství použitých vzorků, které ovlivňují sílu analýzy. Tedy - pokud se zkříží kočka divoká s kočkou domácí, potomci první generace (označované jako F1) mají zhruba polovinu DNA od kočky domácí a druhou polovinu od kočky divoké. Pokud se tento jedinec F1 generace následně páří s kočkou divokou, jejich potomci (z hlediska studie hybridizace jde o druhou generaci označovanou jako F2) už budou mít jen zhruba čtvrtinu DNA náležící domácí kočce. U generace F3 by to bylo o něco víc než 10 %. U F4 generace (podíl domácí kočky už je jen kolem 5 %, zatímco 95 % DNA tvoří genom kočky divoké) se dostáváme na úroveň, kdy podíl cizorodého genomu je u daného jedince už natolik zředěný, že je jen obtížně detekovatelný a rozlišitelný od toho, co mohou mít stejné, protože kočka divoká, plavá i domácí pochází z kdysi společného předka. Z ochranářského hlediska už proto stopování hybridů F4 a následných generací nemá v podstatě smysl. Situace je jiná, pokud se hybridní jedinci kříží mezi sebou, v takovém případě k postupnému zřeďování nedochází.


               

Obr. 4: Výstup z Bayesiánské klastrovací analýzy v programu STRUCTURE, pomocí kterého byl jedinec z Dobříšska (u obce Nový Knín) jednoznačně identifikován jako kočka divoká. V rámci grafického výstupu každý sloupec označuje jednoho jedince. Zelená barva sloupce identifikuje tu část genomu, která přísluší kočce divoké, červená barva zas tu, která přísluší kočce domácí. Na konci analýzy je šest prokazatelně hybridních jedinců, kde část sloupce je označena jednou barvou a část druhou. Jsou to jedinci, u kterých je podíl jedné nebo druhé „barvy“ větší než 20 % a menší než 80 %.

Princip analýzy za pomoci mikrosatelitů přibližuje Jarmila Krojerová také ve videu ze Science Slamu MUNI 12. Jde o vědecko-popularizační soutěž, v rámci které vědci zjednodušenou a zábavnou formou prezentují své výzkumy veřejnosti. V rámci letošního ročníku věnovaného genetice je právě toto vystoupení o výzkumu kočkovitých šelem.



Poznámky:

[1] Jedná se definici druhu podle Ernsta Mayra z české wikipedie.

[2] Eichholzer, A. 2010. Testing the applicability of pictures taken by camera-traps for monitoring the European wildcat Felis silvestris silvestris in the Jura Mountains of Switzerland. Master thesis, University of Zürich, Switzerland, 37pp.



JARMILA KROJEROVÁ